手机版 | 登陆 | 注册 | 留言 | 设首页 | 加收藏
当前位置: 网站首页 > 生物技术 > 文章 当前位置: 生物技术 > 文章

细胞爬片制作的详细步骤

时间:2017-10-21    点击: 次    来源:网络    作者:佚名 - 小 + 大

【爬片的准备】

1.爬片可用一般的盖玻片,也可用专用爬片;

 

2.应用盖玻片,可根据自己的需要剪裁成合适的大小,以备置于6孔板、12孔板或24孔板;裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮,或者是口腔科的那种小沙轮,轻轻划一下后,稍用力一掰就分开了。

 

如果接种大皿的话,我一般不将盖玻片切开,直接清洁后放入培养皿中,到染色时再将之切开,这样既保证了细胞均一性,又可同时做几个指标的染色。

 

3.将剪裁好的爬片,置于浓硫酸中浸泡并过夜,第二天先用自来水冲洗20遍,再置于无水酒清中浸泡6小时,再用三蒸水冲洗3遍(个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了,如果不干净的话,细胞帖壁不好),放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

 

4.高压后取出放入烤箱中烤干,备用。烤干后可放入超净台中。

 

5.关于多聚赖氨酸,很多人都将玻片用此处理,以使细胞与玻片结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸,细胞贴壁仍然很好,且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

 

 

【细胞爬片】

 

1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

 

2.加细胞时,根据玻片的大小,先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基,目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,然后放玻片,防止加细胞悬液时玻片漂起,造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。

 

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可

 

4.待细胞贴壁后,可去上清加含药培养基。

 

5.按照实验设计,作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧,张力较大,我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩,这样将爬片轻轻勾起,用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h48h72h等这样时间点的实验的话,将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】

 

细胞爬片取出后,一般用PBS2遍,然后再做固定。当然,根据研究目的,PBS洗也不是一定要做的,比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗,因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

 

另外在保存细胞爬片的时候,我一般用培养皿或板,先在皿底放一层面巾纸,然后再放爬片,这样方便做实验时取片。然后盖上盖子,并在盖子上做标记,为避免混淆,可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。

 

以下为常用的固定液

 

1. 冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。

将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮(放心,丙酮在此温度不会为固体的)细胞爬片取出后,PBS2遍,便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很强的挥发性,注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严,防止其挥发)固定10分钟。取出后,室温吹干,然后放入-20℃保存。

 

2. 多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。

主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等

室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存

 

3. 95%乙醇,可用于免疫组化。

优点:穿透性强、抗原性保存较好。

缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度

室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存

 

4. 甲醛(福尔马林)应用最广

优点:形态结构保存好,且穿透性强,

缺点: 甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

 

 

 


上一篇:怎么阅读质粒图谱?质粒阅读常识

下一篇:最全EndNote 杂志输出格式2017 6827种

本站内容如有争议请联系E-mail:admin@82247.com   本站版权(C)82247.com 2018  

沪ICP备14043986-1号 | 沪公网安备 31009102000012号