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获得完美的免疫荧光/免疫组化的关键步骤

时间:2017-05-21    点击: 次    来源:网络    作者:佚名 - 小 + 大

免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种,它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术,通过将抗体与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括,细胞固定和通透,封闭,孵育一抗,二抗等。除了这些基本步骤,以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。


1、细胞固定和通透

为达到最佳的检测效果,细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键,细胞和抗原需要保证最佳的结构,并利于抗体与抗原结合。通常情况下,需要通过以下步骤得以实现:细胞用2%-4%多聚甲醛固定,之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理,但是对于核内抗原可能无效,需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时,要注意它会引起细胞膜的可逆性通透,也就是除了在通透初期,在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外,细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透,可以避免去垢剂的使用。

2、抗体特异性

免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体,可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下,纯化抗体的效果很好,但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照,有利于减少降低背景干扰。

3、合适的抗体稀释比例

通过优化抗体稀释比例来优化染色,通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下,可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第一次使用该抗体或测定某抗原,强烈建议浓度梯度实验。

4、优化缓冲液和封闭剂

尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色,但是对于某些目的抗原,更换一下含有不同离子的缓冲液,比如钙、镁、钾等,可以带来很大程度上的改善。Rockland可提供优化过的IHC用封闭缓冲液,同样适用于荧光染色实验。

5、选择正确的二抗

如果您需要做免疫实验,我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验;如果是双重甚至是多重染色,那么必须使用预吸附的二抗。同时,请优先选择来自同一物种的二抗。

6、使用合适的细胞密度

选择合适的细胞数量进行染色,当细胞数量过多时,细胞结构不好,导致染色背景深,低细胞密度,会使细胞贴壁不佳,状态不好。

7、多重染色

对同一样本进行两个不同抗原的检测时,可以用各自的抗体进行同时染色,但要求两个一抗的种属来源不同,标记物不同,而二抗的种属来源需保持一致。

8、降低背景

高背景是免疫荧光常见的问题,解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替BSA做封闭液,降低抗体浓度,增加洗涤次数,洗涤至少三次,每次五分钟,推荐洗涤液为PBS+0.05%Tween。

9、封片

作为免疫荧光的最后一步,可以提高折射率,保护样品。

10、数据分析

观察整体样片时,选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。

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