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碱裂解法提取质粒DNA

时间:2017-05-05    点击: 次    来源:网络    作者:佚名 - 小 + 大

碱裂解法提取质粒DNA

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb~200kb以上不等。存在于细胞之中,独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成分。

 

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的一种方法,它利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异来达到分离的目的。其基本原理为:当菌体在NaOHSDS溶液中(PH12.6)裂解时,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的氢键也大部分断裂,双螺旋也有部分解开,但共价闭合环状结构的两条互补连不会完全打开,当加入KAcPH4.8)中和后,质粒DNA分子能够迅速复性,成溶解状态,离心时留在上清中,蛋白质与染色体DNA难于复性而成絮状,离心时可与细胞碎片一起沉淀下来。

 

试剂:

1.溶液I:   50mmol/L 葡萄糖 (使悬浮的大肠杆菌不会快速沉积到底部,其次调节渗透压)

         25 mmol/L Tris.HCl (PH8.0)  (缓冲体系)

          10 mmol/L EDTA PH8.0(Ca离子、Mg离子等二价阳离子的螯合剂,抑制DNase

活性)

 

2.溶液II: 使用前临时配制

 0.2 mmol/L NaOH  (溶解细胞)

         1% SDS         (使细胞膜崩解)

    与此同时,提高溶液PH,使染色体DNA、蛋白质及质粒均变性。

  

3.溶液III100mL

 5mol/LKAc 60mL   (NaK置换成十二烷基磺酸钾PDSPDS结合蛋白质沉淀,同时牵连染色体发生沉淀)  

          冰醋酸     11.5 mL(中和NaOH,长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和。基因组DNA一旦发生断裂,只要是50100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了)

         ddH2O     28.5 mL  

注意:

   NaOH是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。要新从浓NaOH稀释制备0.2MNaOH,无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

 

溶液II处理这一步要记住两点:第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。

 

溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,其次大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了,因为基因组DNA太长了,长长的DNA自然容易被PDS给合共沉淀了,尽管SDS并不与DNA分子结合。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置,目的是为了PDS沉淀更充分一点。

 

PDS沉淀的形成不能能将所有的蛋白质沉淀了,其实还有很多蛋白质不能被沉淀,因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提,然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA,不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。

 

操作步骤:

1.      挑取LB培养基上生长的单菌落,接种于3.0mLAmpLB液体培养基中,37℃,250rmp震荡培养12~16小时。

2.      1.5mL细菌培养液于灭菌EP管中,4℃,6000rmp离心10min,弃上清,使液体尽量控干。

3.      将沉淀悬于250μl溶液I中,室温静置2min

4.      加入250μl溶液II,颠倒混匀,不要剧烈震荡,常温静置5min

5.      加入250μl预冷的溶液III,颠倒混匀,置于冰上放置10min

6.      4℃,14000rpm,离心10min,将上清转入新的灭菌EP管中。

7.      加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,震荡混匀5min

8.      4℃,14000rpm,离心10min,小心吸出上层水相,转移另一干净EP管中。

9.      加入1倍体积的异丙醇,混匀后冰上静置20min

10.   4℃,14000rpm,离心10min,弃上清,加入0.5mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。(不要把沉淀弄碎)

11.   10000rmp,离心2min,弃上清。将沉淀在室温下晾干。

12.   将沉淀于20μlTE(含RNase)中,37℃保温0.5~1h-20℃保存。

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