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基因表达质粒载体构建流程手册

时间:2017-05-05    点击: 次    来源:网络    作者:佚名 - 小 + 大

一:pMind-AAA的构建

Mycobacterium smegmatis str. MC2155, complete genome

GenBank: CP001663.1

1:设计合成AAA 引物

Forward primerCCATATGAGCAAGCAGATTGAATTCAACG(NdeⅠ,29bp,Tm 59℃,)

Reverse primerTACGCGTGTGAAATGGATCAGTGAGC ( MluⅠ,26bp,Tm 60℃)

2M.smeg AAA 基因的扩增
   (1)PCR反应
       M.smeg genomic DNA为模板,进行PCR扩增
   (2)PCR产物回收纯化

3pJET-Ms AAA 的构建
   (1):连接转化:将上述回收的PCR产物与pJET载体连接,转化至NovaBlue 菌株
   (2):重组质粒提取鉴定:挑取单菌落,过夜培养,提取重组质粒,酶切鉴定
   (3)Ms AAA 测序

4pMind-AAA构建
   (1):用NdeⅠ、MluⅠ酶切pMind和pJET-AAA质粒,切胶回收载体和目的片段,
       连接,转化至NovaBlue菌株
   (2):重组质粒提取,酶切鉴定

5:pMind-AAAM.smeg中构建
  (1)M.smeg感受态细胞的制备
  (2):电转化:将pMind-AAA质粒电转至M.smeg菌株中

6Ms AAAM.meg中的表达与纯化
  (1):挑取单菌落,培养,经四环素(Tc)诱导表达Ms AAA蛋白表达,
          SDS-PAGEWestern Blot确定最佳诱导条件。
  (2)
Ni+-NTA亲和层析纯化Ms AAA蛋白,SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度

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