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特殊标本RNA提取方法

时间:2017-05-05    点击: 次    来源:网络    作者:佚名 - 小 + 大

1.先冻存过的的软骨组织块剪碎,研磨成糜状,加入Trizol 后放在4℃,浸泡裂解过夜。当软骨组织完全溶解于Trizol中,呈乳状悬液后,与细胞裂解液一起按照常规方法分别抽提总RNA。

2.在核酸提取时,为了增加细胞的裂解度,增加核蛋白复合体破碎度,以释放更多的游离核酸,在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K,在确保没有核酸水解酶存在的前提下,酶反应时间越长越好。

3.有时在使用蛋白酶时,为了抑制核酸水解酶的降解作用,可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL,并且可将反应温度提高到50-60℃,并将反应时间缩短到15-25min,但酶用量必须提高10-20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA,因游离金属离子对酶有抑制。

4.许多植物材料中富含酚,在细胞破碎时,在多酚氧化酶作用下,被氧化成有色的锟类物资,影响核酸的提取及降低提取质量,在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体,在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。

6.许多生物材料在提取核酸时,都会遇到多糖的污染问题,具体表现为有机溶剂沉淀时,沉淀很多,但复溶时,大量沉淀不溶,电泳观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法:

 7. CTAB多次抽提。

 8.在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度(可到10倍左右),对低浓度样品再进行沉淀。

 9.在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂,此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积,异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存10.在将使大量多糖存在在溶液中,从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。

11.在核酸提取时,酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿,但酚与水有一定的互溶,因此酚抽后,除可能损失部分核酸外,水相中还会残留酚,而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制,因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性,也可用单一酚作变性己,但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。

12.在操作中当加入变性剂氯仿后,为了保证核酸样品的完整性,操作要轻,尤其在提DNA时,更要避免剧烈操作。

13.在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2V乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。

14.在提取核酸时,如样品浓度低,则应增加有机溶剂沉淀时间,-70℃下>30min;-20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。

15.在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高,而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中,因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存,低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。

16.核酸提取后可通过PCR 、RT-PCR直接扩增出目的基因片断,也可首先构建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针,再用此探针从文库中筛选出完整基因。

17.在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数.提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短。

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