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QPCR引物设计要点

时间:2017-04-19    点击: 次    来源:网络    作者:不详 - 小 + 大

QPCR引物设计要点
一、 设计对象及分析目的
1. 分析对象则为设计对象;但具体的实验对象因具体的实验方法而异;
2. 表达水平分析(定量):RNA(mRNA, lncRNA, rRNA, tRNA, miRNA, piRNA);
3. 存在分析(定性):DNA (CHIP-QPCR), RNA (RIP-QPCR);
4. 等位基因拷贝数分析:DNA (LOH);
5. 甲基化分析:重亚硫酸盐转化后的基因组DNA序列(可以假设CpG位点的C全部发生甲基化,或CpG位点的C全部未发生甲基化);
6. 设计模板:序列号或具体的序列(见图1)
二、 设计参数
以在线软件为例:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
1. PCR产物的长度(PCR product size):一般为80-200bp,最好为:90-140 bp(图2);
2. 引物的退火温度(Primer melting temperatures, TM):59-60℃,最优为60℃(在实际进行QPCR反应时,TM值为60℃)(图2);
3. 跨外显子(span an exon-exon junction):其中一条引物落在相邻两个外显子的交界上,其作用是避免所提取的总RNA污染了基因DNA所造成的假阳性(图3),如果设计模板为基因组DNA(重亚硫酸盐处理的DNA序列)则不需遵守;
4. 跨内含子(separated by at least one intron):正反引物分别落在相邻的两个外显子上,其作用是避免所提取的总RNA污染了基因DNA所造成的假阳性(图3),如果设计模板为基因组DNA(重亚硫酸盐处理的DNA序列)则不需遵守;
5. BLAST检索引物的特异性,根据设计对象的属性选择合适的数据库种类(图4),输入检测样本的种属(图5);
6. 引物的要求:长度为18-26bp,最优为23bp, 引物的GC含量为50-60%,引物中连续出现的相同碱基的数目不超过4(图6);
7. 计算引物TM值的参数:QPCR反应体系中的一价盐离子,二价盐离子,dNTP的浓度和引物的浓度均可影响TM值(图7);
8. 引物尽量不含已知的SNP位点(图8),否则存在出现碱基错配的风险;

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